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生物材料表面細(xì)胞黏附是由表面吸附蛋白介導(dǎo)的,材料表面親疏水性對(duì)表面吸附蛋白質(zhì)的構(gòu)象具有重要影響,因而與細(xì)胞相容性有著密切聯(lián)系。盡管有研究認(rèn)為材料表面親疏水性與細(xì)胞相容性關(guān)系不大,但大部分研究均表明適度親水性的表面有利于細(xì)胞黏附和鋪展,而親水性太強(qiáng)或疏水性太強(qiáng)的表面均不利于細(xì)胞的黏附與鋪展,這主要是因?yàn)椴牧媳砻嬗H疏水性直接影響蛋白質(zhì)在材料表面的黏附數(shù)量和構(gòu)象。親水性很強(qiáng)的表面不利于蛋白質(zhì)的吸附,從而不利于細(xì)胞黏附。對(duì)于疏水性很強(qiáng)的材料表面,一方面,非黏附蛋白(如白蛋白)在材料表面的吸附阻礙了黏附蛋白的吸附;另一方面,吸附在高度疏水材料表面的黏附蛋白,其分子鏈的天然構(gòu)象遭到破壞,致使蛋白質(zhì)分子鏈中與細(xì)胞膜表面整合素相結(jié)合的活性位點(diǎn)(RGD)無法完全暴露,不利于細(xì)胞黏附。只有在親水性適度表面,黏附蛋白既可吸附于材料表面,又保持分子鏈天然構(gòu)象,使細(xì)胞黏附多肽RGD較多地暴露出來,從而有利于細(xì)胞在材料表面的黏附和鋪展。

殼聚糖是一種生物衍生的帶正電荷多糖,具有優(yōu)良的生物相容性和降解性能,在軟骨組織工程,人工皮膚等領(lǐng)域得到廣泛研究。近年來,由于其優(yōu)良的成膜性能和良好的光學(xué)性能,殼聚糖膜在角膜組織工程及角膜修復(fù)材料研究領(lǐng)域得到越來越廣泛重視,本課題組也開展了殼聚糖在角膜修復(fù)材料領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用研究。對(duì)殼聚糖及其復(fù)合膜的表面性能進(jìn)行測試與綜合分析,研究材料表面親水性、自由能、化學(xué)基團(tuán)及其分布和表面形貌,并對(duì)其表面特性進(jìn)行改性,對(duì)于角膜修復(fù)材料及其臨床應(yīng)用研究均具有重要的理論意義。

低溫等離子體處理

低溫等離子體可以在室溫下對(duì)材料進(jìn)行表面改性處理,在材料表面引入自由基或活性官能團(tuán),其作用區(qū)域僅限于材料表面100nm范圍以內(nèi),而對(duì)材料本體性能不產(chǎn)生影響。近年來已廣泛應(yīng)用于生物材料的表面改性研究。

本文采用表面接觸角測試、光電子能譜分析、原子力顯微鏡等對(duì)殼聚糖膜表面化學(xué)基團(tuán)及其空間分布、表面形貌等特性進(jìn)行表征,對(duì)殼聚糖膜表面物化特性與其生物學(xué)特性之間的關(guān)系進(jìn)行初步探討。并采用氧化性O(shè)2低溫等離子體對(duì)殼聚糖膜進(jìn)行表面處理,以提高其表面親水性,對(duì)等離子體表面改性的機(jī)理進(jìn)行分析。

O2等離子體處理對(duì)殼聚糖膜表面性能的影響

O2等離子體處理時(shí)間對(duì)表面接觸角和自由能的影響

等離子體處理能夠在材料表面形成活性自由基,這些活性自由基與空氣中的氧氣、水汽等反應(yīng),從而在材料表面引入極性基團(tuán),這些極性基團(tuán)的引入能夠有效改善材料表面的親水性和自由能。表面接觸角測試是表征材料表面親水性的有效途徑。圖1-1(a)是不同等離子體處理時(shí)間下,殼聚糖膜表面接觸角隨處理時(shí)間的變化?？梢钥闯?在100W等離子體功率條件下,短短10s的等離子體處理就可以使殼聚糖膜表面水接觸角從約90°下降到58°,說明其表面親水性得到了改善,繼續(xù)延長等離子體處理時(shí)間,可以進(jìn)一步改善其表面親水性,處理時(shí)間為30s時(shí),其接觸角約為45°,60s的等離子體處理可使接觸角降到35°,120s的等離子體處理可使接觸角進(jìn)一步降低。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,生物材料的表面接觸角處于30°~50°之間,有利于細(xì)胞的黏附和繁殖,因此,采用O2等離子體處理殼聚糖膜,在100W的功率條件下,60s的處理時(shí)間已經(jīng)足夠了。殼聚糖膜表面二碘甲烷的接觸角在等離子體處理下具有同樣的下降變化趨勢,在60s以后殼聚糖膜表面二碘甲烷的接觸角已經(jīng)幾乎不再下降。

圖1-1 O2等離子體處理時(shí)間對(duì)殼聚糖膜表面接觸角(a)和表面自由能(b)的影響 

表面自由能對(duì)材料表面的細(xì)胞黏附性能非常重要,圖1-1(b)是在其他條件相同情況下,殼聚糖膜表面自由能(包括其色散和極性分量)隨等離子體處理時(shí)間變化情況,可看出,未處理殼聚糖膜的表面自由能非常低,且其自由能的絕大部分為色散分量,極性分量非常小,這是因?yàn)闅ぞ厶悄け砻娴臉O性基團(tuán)翻轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到殼聚糖膜的內(nèi)部,而暴露在外的主要是一些非極性基團(tuán)。經(jīng)過O2等離子體處理10s后,其表面能得到了很大的增加,且隨處理時(shí)間的延長,表面自由能有繼續(xù)增加的趨勢。在表面能的增加中,絕大部分為極性分量的增加,而色散分量基本保持不變,這主要是因?yàn)镺2等離子體處理在樣品表面引入了活性自由基,這些活性自由基與空氣中的氧氣、水汽等反應(yīng)形成含氧的極性基團(tuán),使得樣品表面極性增強(qiáng)。表面自由能的適當(dāng)增加有利于改善材料表面細(xì)胞黏附。

O2等離子體處理對(duì)殼聚糖膜表面化學(xué)狀態(tài)的影響

等離子體處理在材料表面引入活性自由基,當(dāng)材料暴露大氣后,這些活性性自由基與空氣中的氧氣、氮?dú)狻⑺冗M(jìn)行反應(yīng),在材料表面引入極性基團(tuán)。圖2-1是殼聚糖膜等離子體處理前后的表面XPS全譜分析,可以看出,樣品表面元素主要為O、N、C,隨著等離子體處理,表面元素沒有發(fā)生變化,但是元素的相對(duì)含量發(fā)生了較大的變化。樣品表面O的含量增加很大,而C的含量則相對(duì)減少,而N的變化不明顯。

圖2-1 O2等離子體處理前后殼聚糖膜表面XPS譜,(a)處理前,(b)處理后(100W,60s) 

圖2-2是O2等離子體處理時(shí)間對(duì)殼聚糖膜表面元素含量的影響,可以看出,殼聚糖膜經(jīng)過O2等離子體處理后,表面C的含量減少,表面O的含量得到了極大的增加,且有一定量的N的增加,但60s后,變化趨緩,說明在表面形成了更多的含O基團(tuán),含O極性基團(tuán)的引入能夠增加其表面親水性,這與表面接觸角的測試結(jié)果相對(duì)應(yīng)。表面O的增加主要有兩個(gè)方面的來源,一為系統(tǒng)中引入的高純O2,在等離子體處理過程中,形成各種含O的自由基和分子碎片等,轟擊樣品表面,在樣品表面形成含O基團(tuán);此外,樣品經(jīng)過等離子體處理后,在表面形成了各種活性自由基,活性自由基會(huì)與空氣中的O2和水汽等反應(yīng),引入含O基團(tuán)。對(duì)于非反應(yīng)性氣體,后者是最主要的表面活化過程。樣品表面N含量增加也是由于表面活性自由基與空氣中N2反應(yīng)的結(jié)果。

圖2-2 O2等離子體處理時(shí)間對(duì)殼聚糖膜表面元素的影響

圖2-3是殼聚糖膜樣品等離子體處理前后的C1s高分辨譜,未處理樣品表面C主要以C-C/C-H、C-O和C=O三種存在的化學(xué)狀態(tài),這是與殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的。隨著等離子體處理,樣品表面引入了更多的O,使得樣品表面C元素的化學(xué)狀態(tài)發(fā)生了大的變化。對(duì)比處理前后的譜圖可以看出,除了其三種化學(xué)狀態(tài)的相對(duì)比例發(fā)生了變化外,在高結(jié)合能端甚至出現(xiàn)了羧酸基團(tuán)COO-,這主要是由于等離子體處理下形成的活性自由基與空氣中的O2反應(yīng)形成的。C-O的比例增加很大,這是等離子體中的粒子能量使得C-C鍵發(fā)生斷裂,形成活性自由基,與O2等反應(yīng),形成C-OH、COOH等極性基團(tuán),使得表面以C-O、C=O和COO-化學(xué)狀態(tài)存在的C的比例增加。

圖2-3 O2等離子體處理前后殼聚糖膜表面C1s XPS,(a)處理前,(b)處理后(60s/100W) 

等離子體處理對(duì)表面形貌的影響

表面平整光潔的材料與組織接觸后,周圍形成的是一層較厚的與材料無結(jié)合的包囊組織。粗糙的材料表面促使細(xì)胞和組織與材料表面附著和緊密結(jié)合。粗糙表面一方面增加細(xì)胞、組織與材料表面的接觸面積,此外,還會(huì)對(duì)細(xì)胞形成擇優(yōu)黏附,有報(bào)道指出,當(dāng)材料表面粗糙度為1~3μm時(shí),可以顯著促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的附著和生長。本實(shí)驗(yàn)分別采用SEM和AFM對(duì)殼聚糖膜的表面形貌進(jìn)行觀察。圖3-1(a)為SEM圖,可以看出,殼聚糖膜表面除了有部分溶劑揮發(fā)殘留微孔外,較為光滑平整。圖3-1(b)為殼聚糖膜表面原子力顯微鏡圖,AFM圖測試表明其表面粗糙度約為3.5nm,這種光滑均一的表面對(duì)殼聚糖膜的透光性是有利的,但作為角膜修復(fù)材料使用,為了增加細(xì)胞在材料表面的黏附,有必要提高材料表面的粗糙度。

圖3-1 殼聚糖膜表面SEM(a)、AFM(b)和粗糙度(c) 

等離子體處理可以在表面形成一定的粗糙度,粗糙度的適當(dāng)增加可以為材料提供更好的細(xì)胞黏附表面,本實(shí)驗(yàn)分別采用SEM和AFM對(duì)殼聚糖膜經(jīng)等離子體處理前后的表面形貌進(jìn)行了觀察。圖3-2為在相同等離子體處理功率,不同等離子體處理時(shí)間下處理前后的殼聚糖膜表面SEM圖?？梢钥闯?未處理殼聚糖膜樣品表面較為均勻,但存在一定的小孔,可能是在成膜過程中,溶劑揮發(fā)不均勻而造成的。經(jīng)過O2等離子體處理60s后,殼聚糖膜表面變得平整均勻,說明等離子體對(duì)殼聚糖膜存在表面清潔作用。等離子體處理120s后,殼聚糖膜表面有少量燒灼痕跡,這是等離子體處理時(shí)間過長引起表面刻蝕而造成的。因而對(duì)于等離子體處理時(shí)間的把握非常重要。

圖3-2 殼聚糖膜表面經(jīng)O2等離子體處理后的SEM圖 

圖3-3分別為采用100W和150W等離子體處理功率下得到的殼聚糖膜表面SEM圖,可以看出100W的等離子體處理殼聚糖膜表面光滑平整,而采用150W處理后,其表面部分位置出現(xiàn)了燒灼痕跡,因而,對(duì)于等離子體處理,功率大小的選擇非常重要,功率過大容易造成表面刻蝕,這與前面的XPS、表面接觸角等測試結(jié)果是相對(duì)應(yīng)的。

圖3-3 不同O2等離子體處理功率下的殼聚糖膜表面SEM圖,(a)100W,(b)150W 

圖3-4為經(jīng)過氧氣等離子體處理后的殼聚糖膜表面AFM,可以看出,因?yàn)榈入x子體刻蝕的作用,殼聚糖膜表面變得較為粗糙,表面粗糙度Rms增加為5.252nm。表面粗糙度的適當(dāng)增加將有利于材料表面細(xì)胞的黏附。

圖3-4 表面O2等離子體處理(100W,60s)殼聚糖膜的表面AFM,(a)掃描面積 10×10μm,(b)掃描面積5×5μm,(c)掃描面積2.5×2.5μm,(d)表面粗糙度計(jì)算